Peranan dalam pergerakan nasional dimulai pada tahun 1934, saat ia menjadi guru di sekolah menengah Muhammadiyah dan Perguruan rakyat. Di samping itu, ia mengadakan kursus pemberantasan buta huruf bagi ibu – ibu di Salemba Tengah dan Paseban. Peranannya dalam memperjuangkan hak – hak kaum perempuan dimulai ketika ikut dalam Kongres Perempuan Indonesia kedua tahun 1935 di Batavia. Pasca kongres, Maria Ulfah dipercaya untuk memimpin sebuah Biro Konsultasi yang bertugas mengurusi segala permasalahan dalam perkawinan, khususnya membantu kaum perempuan yang mengalami kesulitan dalam perkawinan. Pada masa pendudukan Jepang, Maria Ulfah memilih untuk bekerja di Departemen Kehakiman (Shikooku).

Dalam sidang BPUPK tanggal 13 Juli 1945, Ny. Maria Ulfah Santoso mengatakan bahwa hak – hak dasar perlu dimasukkan dalam Undang – Undang Dasar. Oleh karena itu, Maria Ulfah dianggap sebagai anggota BPUPK yang berhasil memasukkan Pasal 27 UUD 1945 tentang kesetaraan warga negara di dalam hukum tanpa pengecualian.

Setelah proklamasi kemerdekaan, Maria Ulfah ditugaskan Sutan Sjahrir untuk menjadi liaison officer, yaitu sebagai penghubung antara pemerintahan republik dengan pemerintah Sekutu. Kemudian, dipercaya Perdana Menteri Sutan Sjahrir untuk duduk sebagai Menteri Sosial dalam Kabinet Sjahrir II dan III. Selain itu, Maria Ulfah juga mengeluarkan Maklumat Kementerian Sosial tentang hari buruh sedunia. Sejak tanggal 19 Agustus 1947 hingga September 1962, Maria Ulfah menjabat sebagai Sekretaris Perdana Menteri dan Sekretaris Dewan Menteri, selanjutnya jabatan tersebut dirumuskan menjadi Direktur Kabinet RI. Beliau juga menjadi anggota Dewan Pertimbangan Agung (DPA) tahun 1968 – 1973.